The endocannabinoid system in critical neurodevelopmental periods: Focus on its role in the pathophysiology of schizophrenia as neurodevelopmental disorder [Il sistema endocannabinoide nei periodi critici del neurosviluppo: Focus sul suo ruolo nella fisiopatologia della schizofrenia come disturbo dello neurosviluppo]

Background: Prenatal age and adolescence are both crucial periods when exposure to several insults (such as infections, drugs of abuse like Cannabis, environmental pollutants, etc.) combined with genetic risk factors could affect the central nervous system (CNS) development, leading to cognitive, emotional, and social alterations in adulthood, which are common hallmarks of psychopathology including schizophrenia (SCZ). Along with strong evidence supporting the involvement of the endocannabinoid system (ECS) in the pathophysiology of SCZ, this thesis investigated the role of ECS in brain development and the therapeutic potential of early pharmacological modulation of the ECS as a preventive SCZ treatment. Methods- For Animal studies: Animal models for prenatal/perinatal experiments: Methylazoxymethanol acetate (MAM) rat model (GD 17, 22 mg/kg, intraperitoneally, i.p.) (male), Prenatal rat delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) model (GD 5-GD 20, 2 mg/kg/day, subcutaneously, s.c.) (male and female), Prenatal rat cannabidiol (CBD) model (GD 5-GD 20, 10 mg/kg/day, subcutaneously, s.c.) (male and female), Perinatal rat THC model (GD 5-PND 7, 5 mg/kg/day, orally, o.s.) (male), Early rat treatment with CB1 antagonist/inverse agonist AM251 (PND 2-PND 8, 0.5 mg/kg/day, i.p.) (male); Animal models for peripubertal experiments: Adolescent rat THC model (PND 29-PND 39, increasing dose 2.5-5-10 mg/kg/day, i.p.) (male), Adolescent rat treatment with CB1 receptor antagonist/ inverse agonist AM251 (PND 19-PND 39, 0.5 mg/kg/day, ip) (male), Adolescent rat treatment with typical antipsychotic haloperidol (HAL) (PND 19-PND 39, 0.6 mg/kg/day, i.p.) (male); For behavioral characterization neonatal reflexes: the following reflexes were scored: righting, cliff aversion, forelimb placing, forelimb grasping, bar holding and negative geotactic reaction in order to assess brain maturation, muscle tone/equilibrium and integrity of cerebellum was assessed in gait test, odor discrimination of the nest in a novel environment in nest-seeking behavior, spontaneous locomotor activity was assessed in the open field test (OFT), social activity in the social interaction test (SIT) and cognitive performance in the novel object recognition test (NORT); For biochemical analysis we measured in selected brain regions/whole brain: 1) endogenous cannabinoids (ECs) levels and kynurenic acid (KYNA) by liquid chromatography and mass spectrometry, 2) mRNA quantification of ECS and dopaminergic (DA) elements by quantitative real-time polymerase chain reaction, 3) protein expression of ECS elements by western blot analysis, 4) epigenetic mechanisms: DNA methylation at level of CNR1 (encoding CB1 receptor) and DRD2 (encoding D2 receptor) regulatory regions by pyrosequencing. We also performed blood leukocytes: lymphocytes, monocytes and granulocytes quantification by flowcytometry. Methods- For Human studies: For biochemical analysis 1) DNA methylation at level of CNR1 and DRD2 regulatory regions in saliva samples of psychotic subjects by pyrosequencing. Results-From Animal studies: We found in prefrontal cortex (PFC) of prenatal MAM and prenatal/perinatal THC exposed rats at adolescence and/or adulthood behavioral deficits such as cognitive impairment in NORT and reduced social interaction in SIT as well as alteration of the DAergic (in terms of dopamine D2/D3 receptor expression) and endocannabinoid signaling (in terms of cannabinoid CB1 receptor expression), which we attributed to changes in DNA methylation at key regulatory gene regions These abnormalities were preceded at neonatal age by delayed neonatal reflexes and/or 2-AG increased brain level. Schizophrenia-like deficits in adult rats evoked by MAM were reversed by the early treatment (neonatal age) with AM251. Cognitive deficit in adult MAM rats, which was associated with enhanced PFC KYNA levels, was also reversed by peripubertal treatment with AM251 but not with HAL. Prenatal CBD exposure impacted less negatively on neurodevelopment compared to prenatal THC (characterized of social and cognitive impairments in male and female rats) causing anomalies at neonatal age (delays in neonatal reflexes) and social impairment in SIT only in male rats. Prenatal CBD adolescent rats (male and female) presented altered D2 receptors expression but not CB1 receptors. Adolescent THC treatment alone caused impairment in social behavior in SIT but not in cognitive performance in NORT. Adolescent THC treatment was able to rescue detrimental behavioral alterations in terms of cognitive deficits in the MAM model at adult age and did not exacerbate the detrimental effects evoked by perinatal THC exposure in adult rats. Results-From Human studies: Significant increase in DNA methylation at the promoter of CNR1 gene and at the promoter of DRD2 gene detected in psychotic subjects. We also showed that these DNA methylation levels were lower in psychotic subjects reporting current delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) consumption, resembling those of controls at least for the DRD2 gene. Conclusion:The exposure to MAM or THC during critical periods of life for neurodevelopment (i.e., pre/perinatal and/or adolescence) causes alterations in behavior (social and cognitive impairments), in the ECS/DAergic system, in kynurenic acid (KYNA) brain levels and in the epigenetic mechanisms (DNA methylation) that are always preceded at neonatal age by delays in neurodevelopmental and paralleled with findings in psychotic patients. CNR1 and DRD2 gene regulation has key role in psychosis and DNA methylation levels at specific CpG sites could represent a potential biomarker in psychotic subjects not consuming THC. Prenatal CBD exposure produces neuropsychiatric phenotypes including changes in the immune system of rodents, which contradicts the long-standing public belief that CBD is an effective, therapeutic and safe alternative to THC during pregnancy. We used male offspring in the most of preclinical studies performed. The only study performed in male and female offspring was the one where we investigated the prenatal exposure to THC and CBD. However, we cannot exclude potential gender-related effects in the MAM model and in perinatal/adolescent THC model; thus, further studies will be required to clarify the behavioral and molecular responses of female MAM, perinatal THC, adolescent THC offspring. In summary, our findings emphasize the critical role of the ECS during periods of fetal/neonatal and adolescent brain development. In the translational realm, our results further support the modulation of ECS as a possible preventive or therapeutic strategy in SCZ.

INTRODUZIONE: Il periodo intrauterino, l’infanzia e l’adolescenza sono periodi cruciali, in cui l'esposizione a diversi insulti (infezioni, sostanze d’abuso come la Cannabis, inquinanti ambientali, ecc.) combinata con fattori di rischio genetici potrebbe influenzare lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC), determinando alterazioni delle funzioni cognitive, emotive e sociali in età adulta, che sono i tratti distintivi comuni di diverse psicopatologie, tra cui la schizofrenia (SCZ). Insieme a forti prove a sostegno del coinvolgimento del sistema endocannabinoide nella fisiopatologia della SCZ, questa tesi si è posta l’obiettivo di studiare il ruolo del sistema endocannabinoide (EC) nello sviluppo cerebrale e il potenziale terapeutico della modulazione farmacologica precoce del sistema endocannabinoide come trattamento preventivo della SCZ. Metodi- Per gli studi sugli animali: Modelli animali per gli esperimenti condotti in età prenatale/perinatale: Modello gestazionale di esposizione all’ acetato di metilazossimetanolo (MAM) [giorno gestazionale (GD) 17, 22 mg/kg, per via intraperitoneale, i.p.] (ratti di sesso maschile), modello di esposizione prenatale al delta-9-tetraidrocannabinolo (THC) (GD 5-GD 20, 2 mg/kg/die, per via sottocutanea, s.c.) (ratti di entrambi i sessi ), modello di esposizione prenatale al cannabidiolo (CBD) (GD 5-GD 20, 10 mg/kg/die, per via sottocutanea, s.c.) (ratti di entrambi i sessi ), (modello di esposizione perinatale al THC (GD 5-PND 7, 5 mg/kg/die, per via orale, o.s.) (ratti di sesso maschile), trattamento precoce con antagonista/agonista inverso CB1-AM251 [dal giorno post-natale (PND) 2-PND 8, 0,5 mg/kg/die, i.p.] (ratti di sesso maschile); Modelli animali per gli esperimenti condotti durante il periodo adolescenziale: Modello di esposizione adolescenziale al THC (PND 29-PND 39, dosi crescenti 2,5-5-10 mg/kg/die, i.p.) (ratti di sesso maschile), trattamento durante l’adolescenza con antagonista del recettore/agonista inverso CB1-AM251 (PND 19-PND 39, 0,5 mg/kg/die, ip) (ratti di sesso maschile), trattamento durante l’adolescenza con aloperidolo, antipsicotico tipico (HAL) (PND 19-PND 39, 0,6 mg/kg/die, i.p.) (ratti di sesso maschile); Per la caratterizzazione comportamentale: sono stati esaminati i seguenti riflessi neonatali: raddrizzamento, avversione alle altezze, posizionamento degli arti anteriori, presa degli arti anteriori, tenuta della barra e reazione geotattica negativa al fine di valutare la maturazione cerebrale, il tono/equilibrio muscolare e l’ integrità del cervelletto, sono stati analizzati nel test dell'andatura, la discriminazione degli odori del nido in un nuovo ambiente è stata valutata tramite il test del comportamento di ricerca del nido, l'attività locomotoria spontanea è stata esaminata nel test in campo aperto (OFT), l'attività sociale nel test di interazione sociale (SIT) e la performance cognitiva nel test di riconoscimento del nuovo oggetto (NORT); Per l'analisi biochimica abbiamo misurato in regioni selezionate a livello cerebrale/intero cervello: 1) i livelli di cannabinoidi endogeni e dell’acido chinurenico (KYNA) mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa, mRNA di elementi del sistema EC e dopaminergico (DA), mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale, 3) espressione proteica di elementi del sistema EC, mediante analisi western blot, 4) meccanismi epigenetici: metilazione del DNA a livello di regioni regolatorie CNR1 (gene codificante per il recettore cannabinoideo CB1) e DRD2 (gene codificante per il recettore dopaminergico D2) mediante pirosequenziamento. Abbiamo anche quantificato il livello di leucociti periferici presenti nel sangue, rispettivamente linfociti, monociti e granulociti mediante la tecnica di citometria a flusso; Metodi- Per gli studi sull'uomo: Per l'analisi biochimica abbiamo misurato 1) la metilazione del DNA a livello delle regioni regolatorie di CNR1 e DRD2 in campioni di saliva di soggetti psicotici mediante pirosequenziamento. Risultati (studi sugli animali): Abbiamo trovato nella corteccia prefrontale (PFC) di ratti esposti prenatalmente al MAM e prenatalmente/perinatalmente al THC deficit comportamentali come il deterioramento cognitivo nel NORT e la ridotta interazione sociale nel SIT durante l'adolescenza e/o l'età adulta. Inoltre, abbiamo trovato l'alterazione della segnalazione DA (in termini di espressione del recettore D2/D3 della dopamina) ed endocannabinoidea (in termini di espressione del recettore cannabinoideo CB1), che abbiamo attribuito a cambiamenti nella metilazione del DNA in regioni geniche regolatorie chiave. Queste anomalie erano precedute in età neonatale da riflessi neonatali ritardati e/o aumento del livello cerebrale dell’endocannabinoide 2-AG. La comparsa di deficit simil-schizofrenici indotta dall’ esposizione al MAM nei ratti adulti è stata prevenuta dal trattamento precoce (età neonatale) con AM251. Il deficit cognitivo nei ratti MAM adulti, che era associato a livelli aumentati di KYNA nella PFC, è stato revertito anche dal trattamento (in età peripubertale) con AM251 ma non dal trattamento con HAL. L'esposizione prenatale al CBD ha avuto un impatto meno negativo sullo sviluppo neurologico rispetto al modello di esposizione al THC prenatale (caratterizzato da disturbi sociali e cognitivi nei ratti maschi e femmine) poiché ha causato anomalie in età neonatale (ritardi nei riflessi neonatali) e compromissione sociale nel SIT solo nei ratti maschi. I ratti adolescenti esposti prenatalmente al CBD (maschi e femmine) presentavano un'espressione alterata dei recettori D2 ma non dei recettori CB1. Il trattamento con THC negli adolescenti da solo, ha causato una compromissione del comportamento sociale nel SIT, ma non della performance cognitiva nel NORT. Il trattamento con THC negli adolescenti è stato in grado di trattare le alterazioni comportamentali dannose in termini di deficit cognitivi nel modello MAM in età adulta e non ha esacerbato gli effetti dannosi causati dall'esposizione perinatale al THC nei ratti adulti. Risultati (studi sull'uomo): Abbiamo trovato un aumento significativo della metilazione del DNA a livello del promotore del gene CNR1 e del promotore del gene DRD2 in soggetti psicotici. Abbiamo anche dimostrato che i livelli di metilazione del DNA erano più bassi nei soggetti psicotici che riportavano il consumo corrente del delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), nello specifico, erano simili a quelli dei controlli almeno per il gene DRD2. Conclusioni: L'esposizione al MAM o al THC durante i periodi critici della vita per il neurosviluppo (cioè età pre/perinatale e/o adolescenza) provoca alterazioni nel comportamento (disturbi sociali e cognitivi) e nei meccanismi molecolari ovvero: alterazioni del sistema EC/DAergico, alterazioni dei livelli cerebrali di acido chinurenico e di alcuni meccanismi epigenetici (metilazione del DNA) che sono sempre preceduti in età neonatale da ritardi nello sviluppo neurologico che riflettono i risultati riscontrati nei pazienti psicotici supportando il valore traslazionale di questi modelli. La regolazione dei geni CNR1 e DRD2 ha un ruolo chiave nella psicosi; pertanto, i livelli di metilazione del DNA in specifici siti CpG di tali geni, potrebbero rappresentare potenziali biomarcatori in soggetti psicotici che non consumano THC. L'esposizione prenatale al CBD produce fenotipi neuropsichiatrici nei roditori incluse alterazioni del sistema immunitario, il che contraddice la convinzione pubblica di lunga data, che il CBD sia un'alternativa terapeutica efficace e sicura al THC durante la gravidanza. Nella maggior parte degli studi preclinici condotti, sono stati utilizzati roditori di sesso maschile. L'unico studio condotto su prole di sesso maschile e femminile è stato quello in cui abbiamo indagato l'esposizione prenatale al THC e CBD. Tuttavia, non possiamo escludere potenziali effetti legati al genere nel modello MAM e nel modello THC perinatale/adolescenziale; pertanto, saranno necessari ulteriori studi per chiarire le risposte comportamentali e molecolari riguardanti tali modelli. In sintesi, i nostri risultati sottolineano il ruolo critico del sistema endocannabinoide durante i periodi di sviluppo cerebrale fetale/neonatale e adolescenziale. Nell'ambito traslazionale, i nostri risultati supportano ulteriormente la modulazione del sistema endocannabinoide come possibile strategia preventiva o terapeutica nella SCZ.