Pharmacological targets for treatment of retinal neurodegenerations: new perspectives [Nuove prospettive sui target farmacologici per il trattamento della neurodegenerazione retinica]

Glaucoma and diabetic retinopathy represent retinal degenerative diseases and leading causes of blindness worldwide. Despite the different etiology and pathogenesis, morphological and functional impairment of retinal cells is a common event of these pathologies. Particularly, glaucoma, a progressive optic neuropathy, is characterized by degeneration of retinal ganglion cells (RGCs), triggered by the elevation of intraocular pressure (IOP). The subsequent death of RGCs leads to optic nerve damage and peripheral and central visual field loss. The apoptosis of RGCs has been linked to multi-factorial pathogenic mechanisms such as axonal transport blockade, neurotrophic factors deprivation, mitochondrial dysfunction, excitotoxic damage, oxidative stress and inflammation. Diabetic retinopathy (DR) is a microvascular complication of diabetes caused by the chronic exposure to hyperglycemia which finally leads to neovascularization, vessel leakage and blood retinal barrier (BRB) breakdown. Additionally, retinal neurodegeneration has recently been described as an early event in DR, preceding and contributing to microcirculatory abnormalities. DR-induced microvasculature alterations are triggered by the activation of different pathological mechanisms, such as oxidative stress, chronic inflammation and mitochondrial dysfunction. Up to now therapies provided for DR and glaucoma do not prevent the early events and the progression of these disorders. Particularly, as regard as glaucoma, the currently approved pharmacological treatments reduce IOP, the main risk factor of this disease. These therapies consist of topical ocular hypotensive drugs which reduce the production of aqueous humor or facilitate its drainage through outflow pathways. However, currently, there is no approved pharmacological treatment aimed to counteract the loss of vision by directly targeting RGCs. Similarly, in DR the lack of neuroprotective strategies represents an important unmet medical need. In fact, the approved pharmacological treatments are intravitreal anti-VEGF drugs and corticosteroids, which mainly act by counteracting retinal neovascularization and inflammation. Therefore, the research and development (R&D) of new molecules able to preserve retinal cells and visual system from degeneration, addressing early molecular events, could increase the therapeutical options for glaucoma and DR. In this effort, network pharmacology approach has recently been revealed as a new strategy to boost the R&D of drugs in ocular pharmacology field, as discussed in chapter I. Particularly, it could be useful to identify new potential pharmacological targets, as well as to understand the biological processes underlying complex diseases and to analyze the mechanisms of action of investigational drugs. In fact, through the application of systems pharmacology, a holistic approach based on systems biology methods, a biological problem is studied as a network of interactions at different scales, in contrast to reductionist biology. In detail, in this type of in silico studies, a complex disease is represented as a network of interactions (edges) between the nodes, representing genes, proteins, molecules or pathways, in which the deletion of a central node could compromise the stability of the network. Thereby, in the second chapter, a system pharmacology approach has been applied to identify new pharmacological targets for glaucoma disease. Particularly, a third-party re-analysis of transcriptomic data retrieved on Gene Expression Omnibus (GEO) database, and subsequent GEO2R statistical analysis have been carried out. As a result, the top differentially expressed genes (DEGs) between healthy control groups and experimental models of glaucoma have been identified. Subsequently, these top DEGs have been inserted in STRING software, integrated as application in Cytoscape, to carry out an enrichment information approach and to build gene-gene interaction networks. After centrality metrics analysis of the networks, the most important nodes (genes) in the stability and modularity of the network, which could play a key role in glaucoma pathogenesis, have been identified. Through the rescoring approach carried out on PubMed and clinicaltrial.gov, innovative targets putatively involved in glaucoma, were highlighted. Indeed, several G proteins coupled receptors (GPCRs), ion channels and enzymes have been found as innovative pharmacological targets for glaucoma. For instance, the metabotropic serotoninergic receptors 5-hydroxytryptamine 5A (HTR5A), 5-hydroxytryptamine receptor 1D (HTR1D), 5-hydroxytryptamine receptor 2C (HTR2C) and the adenosine A2B receptors (ADORA2B), showed «high novelty potential» as drug targets for glaucoma treatment. Moreover, the purinergic ionotropic receptors P2X3 and P2X4, along with the enzymes encoded by CYP2C8, LDHA and MAOB could be worthy of further investigation, due to the lack of preclinical and clinical literature studies. Furthermore, several genes which are known to trigger the activation of signaling pathways crucial in glaucoma pathology, such as HIF-1α, TNF- α or BAX, have been retrieved. However, these pharmacological targets identified in silico, need to be validated in in vitro and in vivo models of glaucoma, as well as by means of clinical studies. In chapter III, the in vitro validation of α1D and α2C adrenergic receptors (α1DR and α2CR), which belong to GCPRs family, has been carried out. These receptors were previously identified as new potential innovative pharmacological targets for DR treatment, by means of network pharmacology approach. Particularly, the contribution of adrenergic receptors in mitochondrial dysfunction of retinal pigment epithelium (RPE) cells and outer BRB breakdown has been studied with an in vitro model of DR. On this purpose, ARPE-19 cells were challenged with high glucose (HG) levels, and receptors selective ligands have been used as pharmacological tool to study the role of α1DR and α2CR. Mitochondrial activity was assessed through Seahorse XF, a technology that enables the measurement of various metabolic parameters and functions using live cells, in real-time. It measures the oxygen consumption rate (OCR), which represents mitochondrial respiration and the extracellular acidification rate (ECAR), an index of glycolysis. Chapter III showed that α1DR pharmacological blockade with BMY 7378 (α1DR antagonist) restored the ARPE-19 OCR and ECAR profiles, decreased by HG challenge. The activation of this receptor through phenylephrine (α1-AR agonist) further worsened the HG-induced impairment in mitochondrial functionality, as proved by OCR measurements. Therefore, these results suggest an involvement of α1D receptor pathway on DR-associated mitochondrial dysfunction, even confirmed by the co-treatment with both α1DR agonist and antagonist in HG conditions. Additionally, BMY 7378 contrarily to phenylephrine treatment, was able to restore the integrity of RPE monolayer affected by HG exposure, evaluated by TEER measurement and Na-F permeability assay, in the same DR in vitro model. Thereby, these results indicate that the block of α1D adrenergic receptor could also exert protective effects against the HG induced outer BRB breakdown. On the contrary, α2C adrenergic receptor was not validated as a pharmacological target for DR treatment, due to the lack of significant effects of receptor ligands on ARPE-19 mitochondrial functionality. To sum up, chapter III opens the way to develop new DR therapeutical strategies, evidencing α1D adrenergic receptor, as a potential pharmacological target for DR treatment, despite further pre-clinical and clinical research are needed. In conclusion, this thesis strengthened the network pharmacology approach as a useful tool to identify new drug targets for complex and multifactorial diseases, such as glaucoma and DR, highlighting the relevance of further in vitro validation.

Il glaucoma e la retinopatia diabetica, malattie degenerative che colpiscono la retina, rappresentano le principali cause di cecità al mondo. Nonostante la differente eziopatogenesi, il deterioramento morfologico e funzionale delle cellule retiniche rappresenta un evento comune ad entrambe le condizioni. In particolare, il glaucoma, una neuropatia ottica progressiva, è caratterizzato dalla degenerazione delle cellule neuronali retiniche (RGCs), che è a sua volta causata dall'aumento della pressione intraoculare (IOP). La conseguente morte di queste cellule porta a danni irreversibili al nervo ottico e alla perdita del campo visivo centrale e periferico. L'apoptosi di tali cellule è stata collegata a meccanismi patogenetici multifattoriali, come ad esempio il blocco del trasporto assonale, la privazione di fattori neurotrofici, la disfunzione mitocondriale, il danno eccitotossico, lo stress ossidativo e processi infiammatori. La retinopatia diabetica (RD) è una complicanza microvascolare del diabete, causata dall'esposizione cronica all'iperglicemia, che in fasi avanzate porta alla neovascolarizzazione e alla rottura della barriera ematoretinica. Inoltre, la neurodegenerazione della retina è stata recentemente descritta come un evento precoce nella RD, che precede e al tempo stesso contribuisce all’instaurarsi delle anomalie microcircolatorie. Le alterazioni della microvascolarizzazione indotte dalla RD sono innescate dall'attivazione di diversi meccanismi patologici, quali lo stress ossidativo, l'infiammazione cronica e la disfunzione mitocondriale. Le terapie esistenti per il trattamento della RD e del glaucoma non prevengono gli eventi precoci di questi disturbi né la progressione di questi ultimi. In particolare, per quanto riguarda il glaucoma, i trattamenti farmacologici attualmente approvati riducono la IOP, il principale fattore di rischio della malattia, sopprimendo la produzione di umor acqueo o facilitandone il drenaggio attraverso le vie di deflusso. Tuttavia, attualmente non esistono dei farmaci approvati per la neurodegenerazione. Analogamente, nella RD la mancanza di strategie neuroprotettive rappresenta un'importante unmet medical need. Infatti, i trattamenti farmacologici approvati sono farmaci biologici con attività anti-angiogenica somministrati per via intravitreale oppure impianti intravitreali per il rilascio controllato e prolungato di corticosteroidi, che mirano a contrastare la neovascolarizzazione e l’infiammazione. Pertanto, la ricerca si è focalizzata sulla scoperta di strategie in grado di preservare le cellule retiniche e il sistema visivo dalla degenerazione, in modo da aumentare le opzioni terapeutiche per le suddette patologie. A tal scopo, come discusso nel capitolo I di questa tesi, l'approccio della “network pharmacology” è recentemente emerso come una nuova strategia nel campo della farmacologia oculare. In particolare, questo metodo si è rivelato utile per identificare nuovi target farmacologici, comprendere l’eziologia di malattie complesse e il meccanismo d'azione di nuovi farmaci. Infatti, attraverso l'applicazione della farmacologia dei sistemi, che rappresenta un approccio olistico basato sui metodi della biologia dei sistemi, un problema biologico è studiato come una rete di interazioni a diverse scale. In particolare, in questo tipo di studi in silico, una malattia complessa può essere rappresentata come una rete di interazione tra diversi nodi, i quali possono essere geni, proteine, molecole o vie di segnalazione. In queste reti, la soppressione di un nodo centrale compromette la stabilità dell’intera rete. Pertanto, l’obiettivo dello studio descritto nel secondo capitolo, è stato quello di identificare nuovi geni coinvolti nella patogenesi del glaucoma utilizzando l’approccio di network pharmacology. In particolare, è stata effettuata una re-analisi dei dati di trascrittomica depositati nei GEO DataSets, rappresentanti modelli sperimentali di glaucoma, e una successiva analisi statistica con GEO2R ha evidenziato i geni differenzialmente espressi (ingl. differentially expressed genes, DEG) in modo significativo (p < 0.05) tra i campioni controllo e quelli modello della malattia (CTRL vs. glaucoma). Mediante i software STRING e Cytoscape sono state messe in evidenza le reti di connessione tra i geni principalmente coinvolti nei campioni biologici analizzati, e attraverso un’analisi di centralità di queste reti sono stati evidenziati potenziali target farmacologici per il trattamento del glaucoma. Inoltre, attraverso un approccio di re-scoring dell’analisi della letteratura (PubMed e clinicaltrial.gov) è stato possibile escludere i geni e le pathway associate a record nei database in esame, concentrandosi quindi su potenziali target innovativi. Dallo studio è emerso che diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), canali ionici ed enzimi potrebbero essere nuovi potenziali target per il trattamento del glaucoma. Per esempio, i recettori metabotropici serotoninergici HTR5A, HTR1D, HTR2C e l’adenosinico ADORA2B, hanno mostrato un elevato potenziale di novità come target per il trattamento del glaucoma. Inoltre, i recettori purinergici ionotropici P2X3 e P2X4, insieme agli enzimi codificati da CYP2C8, LDHA e MAOB potrebbero essere degni di ulteriori indagini sperimentali per la mancanza di studi preclinici e clinici legati ad essi. In più, si è evidenziato il coinvolgimento di diversi geni noti per aver un ruolo nell’eziopatogenesi del glaucoma, come HIF-1α, TNF- α o BAX. Questi dati rappresentano una base per un’indagine sperimentale rivolta alla validazione in vitro e in vivo di target terapeutici innovativi. Nel capitolo III è descritta la convalida sperimentale in vitro dei recettori adrenergici α1D e α2C (α1DR e α2CR), appartenenti alla famiglia dei GPCRs. Questi recettori erano stati precedentemente identificati come target terapeutici innovativi per il trattamento della RD, mediante lo stesso approccio di network pharmacology descritto in precedenza. In particolare, nello studio riportato nel capitolo III è stato analizzato il contributo di tali recettori nella disfunzione mitocondriale delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) e nella rottura della barriera ematoretinica esterna (oBRB) in un modello in vitro della RD (cellule ARPE-19 sottoposte a elevate concentrazioni di glucosio). Inoltre, sono stati utilizzati dei ligandi selettivi di questi recettori come strumento farmacologico al fine di studiare il ruolo di α1DR e α2CR. L'attività mitocondriale è stata valutata con la tecnologia del Seahorse XF, la quale consente la misurazione di vari parametri e funzioni metaboliche utilizzando cellule vive in tempo reale. Tale strumento misura il tasso di consumo dell’ossigeno (OCR), che rappresenta la respirazione mitocondriale e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che è un indice della glicolisi. Nel capitolo III è stato dimostrato che il blocco farmacologico del recettore α1DR con il BMY 7378 (antagonista selettivo dell'α1DR) è capace di ripristinare l’OCR e l’ECAR delle ARPE-19, che erano stati significativamente ridotti dal trattamento con alte dosi di glucosio. Al contrario, l'attivazione di questo recettore attraverso la fenilefrina (agonista del recettore α1-AR) mostrava un ulteriore peggioramento del danno indotto dall’alto glucosio nella funzionalità mitocondriale, come dimostrato dal profilo dell’OCR. Pertanto, questi risultati suggeriscono un coinvolgimento del recettore α1DR nella disfunzione mitocondriale associata alla RD, che è stato ulteriormente confermato dai risultati del co-trattamento con agonista e antagonista di α1DR. Inoltre, attraverso misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale e il test di permeabilità alla Na-F, nello stesso modello in vitro della malattia, BMY 7378, rispetto al trattamento con fenilefrina, è stato in grado di ripristinare l'integrità di barriera delle ARPE-19, significativamente danneggiata dall'esposizione ad alte dosi di glucosio. Pertanto, questi risultati indicano che il blocco del recettore adrenergico α1D potrebbe esercitare effetti protettivi anche sulla rottura della barriera ematoretinica esterna nella RD. Al contrario, il recettore adrenergico α2CR non è stato validato come target farmacologico per il trattamento della RD, a causa della mancanza di effetti significativi dei ligandi del recettore sulla funzionalità mitocondriale delle ARPE-19. Riassumendo, il capitolo III apre la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la cura della RD, evidenziando il ruolo del recettore adrenergico α1D come potenziale target farmacologico, nonostante siano necessari ulteriori studi preclinici e clinici. In conclusione, questa tesi ha messo in risalto come l’applicazione di network pharmacology integrata alla validazione con studi in vitro, sia un valido strumento per identificare nuovi target farmacologici per malattie complesse e multifattoriali, quali il glaucoma e la RD.