Effects of carnosine in experimental models of neuroinflammation: focus on human microglia [Effetti della carnosina in modelli sperimentali di neuroinfiammazione: focus sulla microglia umana]

Microglia, the brain's immune cells, are essential for brain development, synaptic plasticity, and neurogenesis, being responsible of maintaining balance by clearing misfolded proteins and dead cells. The loss of the homeostatic status of microglia has been linked to the development of numerous systemic and neurodegenerative diseases, including type 2 diabetes and Alzheimer disease (AD). In AD, microglia become over-activated, triggering oxidative stress and inflammation, which accelerates neurodegeneration. This pro-inflammatory state, along with and energy metabolism unbalance, has been observed in the early stages of cognitive decline as well as in depressed patients, highlighting as microglial dysfunction and related molecular alterations represent key factors in diseases’ progression, thus pharmacological targets deserving attention. Carnosine is an endogenous dipeptide composed of β-alanine and L-histidine, found at high levels in excitable tissues such as muscles and brain. It possesses a well-established multimodal mechanism of action that includes antioxidant, anti-inflammatory, and anti-aggregant properties. Carnosine has also shown the ability to modulate cell energy metabolism. For these reasons carnosine has been considered a potential therapeutic tool for multifactorial disease conditions such as depression and AD. Since it was never investigated, the first aim of the present thesis was to study the effects of carnosine per se on human microglial cells (HMC3), in terms of changes in cell viability, expression of inflammation and oxidative stress markers, and energy metabolism. The next step was to investigate the therapeutic potential of carnosine in two different in vitro experimental models of neuroinflammation consisting of HMC3 challenged with a combination of lipopolysaccharide (LPS) + ATP or amyloid-beta (Aβ) oligomers. When used alone on human HMC3 microglial cells, carnosine, at the highest concentration (20 mM) significantly decreased cell viability, also increasing interleukin-6 gene expression levels and decreasing that of heme oxygenase 1, while no detrimental effects were at a concentration of 10 mM or below. In particular, carnosine, at the highest non-toxic concentration of 10 mM, improved cellular energy metabolism by increasing the ATP/ADP ratio and energy charge potential (ECP). For this reason, 10 mM was selected as a concentration to be tested in our neuroinflammation-induced models. In HMC3 challenged LPS + ATP, carnosine prevented cell death triggered by the combination of inflammatory stimuli, and this protective activity was paralleled by the reduction of oxidative stress, as indicated by decreased levels of intracellular reactive oxygen species (ROS), nitrite, and nitrate, while simultaneously restoring reduced glutathione (GSH) levels. Carnosine's protective effect was also linked to its ability to rescue cell energy metabolism, shown by its positive regulation of high-energy triphosphates, nicotinic coenzymes, and UDP derivatives. Carnosine treatment was shown to be beneficial in the same cells stimulated with Aβ oligomers, decreasing the intracellular levels of ROS, nitric oxide, and oxypurines, also restoring intracellular GSH levels. Carnosine also played a key role in preserving mitochondrial energy metabolism in microglia as demonstrated by its ability to restore high-energy phosphates, such as ATP, the ratio of nicotinic coenzymes, and UDP derivatives. The findings reported in this thesis strengthen the importance of carnosine's multimodal mechanism of action in exerting neuroprotection, making it a promising therapeutic candidate for multifactorial diseases such as depression and AD.

La microglia, le cellule immunitarie del cervello, sono essenziali per lo sviluppo del cervello, la plasticità sinaptica e la neurogenesi, essendo responsabili del mantenimento dell'equilibrio eliminando proteine mal ripiegate e cellule morte. La perdita dello stato omeostatico della microglia è stata collegata allo sviluppo di numerose malattie sistemiche e neurodegenerative, tra cui il diabete di tipo 2 e la malattia di Alzheimer (AD). Nell'AD, la microglia diventa iperattiva, innescando stress ossidativo e infiammazione, che accelerano la neurodegenerazione. Questo stato pro-infiammatorio, insieme a uno squilibrio del metabolismo energetico, è stato osservato nelle fasi iniziali del declino cognitivo e nei pazienti depressi, evidenziando come la disfunzione della microglia e le alterazioni molecolari correlate rappresentino fattori chiave nella progressione delle malattie, quindi obiettivi farmacologici che meritano attenzione. La carnosina è un dipeptide endogeno composto da β-alanina e L-istidina, presente in alti livelli nei tessuti eccitabili come muscoli e cervello. Possiede un meccanismo d'azione multimodale ben consolidato che include proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antiaggreganti. La carnosina ha anche mostrato la capacità di modulare il metabolismo energetico cellulare. Per queste ragioni la carnosina è stata considerata un potenziale strumento terapeutico per condizioni di malattia multifattoriali come depressione e AD. Poiché non è mai stata studiata, il primo obiettivo della presente tesi è stato quello di studiare gli effetti della carnosina di per sé sulle cellule microgliali umane (HMC3), in termini di cambiamenti nella vitalità cellulare, espressione di marcatori di infiammazione e stress ossidativo e metabolismo energetico. Il passo successivo è stato quello di studiare il potenziale terapeutico della carnosina in due diversi modelli sperimentali in vitro di neuroinfiammazione costituiti da HMC3 sfidato con una combinazione di lipopolisaccaride (LPS) + ATP o oligomeri beta-amiloide (Aβ). Quando utilizzata da sola sulle cellule microgliali umane HMC3, la carnosina, alla concentrazione più elevata (20 mM), ha ridotto significativamente la vitalità cellulare, aumentando anche i livelli di espressione genica dell'interleuchina-6 e diminuendo quelli dell'eme ossigenasi 1, mentre non si sono verificati effetti dannosi a una concentrazione di 10 mM o inferiore. In particolare, la carnosina, alla concentrazione non tossica più elevata di 10 mM, ha migliorato il metabolismo energetico cellulare aumentando il rapporto ATP/ADP e il potenziale di carica energetica (ECP). Per questo motivo, 10 mM sono stati selezionati come concentrazione da testare nei nostri modelli indotti da neuroinfiammazione. Nelle cellule HMC3 trattate con LPS + ATP, la carnosina ha prevenuto la morte cellulare innescata dalla combinazione di stimoli infiammatori e questa attività protettiva è stata parallela alla riduzione dello stress ossidativo, come indicato dai livelli ridotti di specie reattive dell'ossigeno intracellulare (ROS), nitrito e nitrato, ripristinando simultaneamente i livelli ridotti di glutatione (GSH). L'effetto protettivo della carnosina è stato anche collegato alla sua capacità di ripristinare il metabolismo energetico cellulare, dimostrato dalla sua regolazione positiva di trifosfati ad alta energia, coenzimi nicotinici e derivati UDP. Il trattamento con carnosina ha dimostrato di essere benefico nelle stesse cellule stimolate con oligomeri Aβ, riducendo i livelli intracellulari di ROS, ossido nitrico e ossipurine, ripristinando anche i livelli intracellulari di GSH. La carnosina ha anche svolto un ruolo chiave nel preservare il metabolismo energetico mitocondriale nella microglia, come dimostrato dalla sua capacità di ripristinare fosfati ad alta energia, come ATP, il rapporto di coenzimi nicotinici e derivati UDP. I risultati riportati in questa tesi rafforzano l'importanza del meccanismo d'azione multimodale della carnosina nell'esercitare la neuroprotezione rendendola un promettente candidato terapeutico per malattie multifattoriali come depressione e AD.