Investigating the role of cysteine residues on structural and functional integrity of human Voltage-Dependent Anion Channel 2: A comprehensive approach [Studio del ruolo dei residui di cisteina sull'integrità strutturale e funzionale del Canale Anionico Voltaggio-Dipendente 2 umano: un approccio integrato]

Voltage-dependent anion-selective channels (VDACs) are the most abundant family of pore-forming proteins in the outer mitochondrial membrane. They act as the primary interface between the cytosol and the mitochondria. As human VDAC isoforms display 75% sequence similarity, identifying the distinctive structure underlying VDAC-specific functions is challenging. In recent years, a detailed profile of the oxidative state of VDAC cysteines and methionines has been provided using affinity chromatography purification and mass spectrometry. Together with reports from independent research groups, evidence has emerged that the redox state of cysteines may correlate with VDAC-specific functions. This PhD thesis focuses on investigating the structural and functional properties of human VDAC2, which has the highest number of cysteine residues among VDAC isoforms and has several disulfide bonds, which are generally uncommon in beta-barrel proteins. We analyzed the role of these residues on the electrophysiological properties of human VDAC2, performing a planar lipid reconstitution assay with recombinant human native VDAC2 and a cysteine-free variant in which all cysteine residues were replaced with alanine residues. Our results suggest that removing cysteine residues increases the average conductance of membrane-inserted channels and increases gating in response to positive potentials. Molecular dynamic simulations revealed an increase in flexibility of the protein and the N-terminal domain folding back inside the pore, this might be mechanistically related to the changed electrophysiological properties. To corroborate these results in-cellulo, we exploited a heterologous system that expresses VDAC2 variants in POR1-depleted S. cerevisiae strain. Our results showed that cysteines are necessary to maintain protein stability, ensuring efficient and correct VDAC2 biogenesis. Together, our results provided new insights into the role of the cysteine redox state of VDAC2, explaining the biological role of the high number of cysteine residues of the second isoform of human VDACs.

Le proteine Voltage-Dependent Anion-Selective Channels(VDAC) sono la famiglia più abbondante di proteine porogene nella membrana mitocondriale esterna (OMM). Essi fungono da interfaccia primaria tra il citosol e i mitocondri. Poiché le isoforme VDAC presentano una similarità di sequenza del 75%, è difficile identificare le differenze strutturarali alla base delle funzioni specifiche dei VDAC. Negli ultimi anni, è stato fornito un profilo dettagliato dello stato ossidativo delle cisteine e delle metionine dei VDAC utilizzando la purificazione mediante cromatografia di affinità e la spettrometria di massa. Insieme alle relazioni di altri gruppi di ricerca, sono emerse prove che lo stato redox delle cisteine potrebbe essere correlato alla funzione specifica dei VDAC. Questa tesi di dottorato si concentra sullo studio delle proprietà strutturali e funzionali del VDAC2, che ha il numero più alto di residui di cisteina tra le isoforme VDAC e presenta diversi legami disolfuro, generalmente rari nelle proteine β-barrel. Per analizzare il ruolo di questi residui sulla funzionalità della proteina, abbiamo eseguito saggi di planar lipid bilayer utilizzando proteine ricombinanti di VDAC2 native o una variante in cui tutte le cisteine sono state sostituite con alanine, così da investigare le proprietà elettrofisiologiche della proteina. I nostri risultati suggeriscono che la rimozione delle cisteine aumenta la conduttanza media dei canali inseriti nella membrana artificiale e aumenta il gating in risposta a potenziali positivi, alterando le tipiche caratteristiche elettrofisiologiche del VDAC2. Simulazioni di dinamica molecolare hanno rivelato un aumento della flessibilità della proteina e dell ripiegamento del dominio N-terminale all'interno del poro, ciò potrebbero essere correlato ai cambiamenti elettrofisiologici osservati in-vitro. Per validare questi risultati in-cellulo, abbiamo sfruttato un sistema eterologo che esprime le varianti di VDAC2, con e senza cisteine, in ceppi di S. cerevisiae privi della porina nativa di lievito. I nostri risultati hanno dimostrato che le cisteine sono necessarie per mantenere la stabilità della proteina, garantendo una biogenesi efficiente e corretta di VDAC2 al mitocondrio. Nel complesso, questo lavoro di tesi fornisce nuove informazioni sul ruolo dello stato redox delle cisteine della VDAC2, spiegando il ruolo biologico dell'elevato numero di residui di cisteina nella seconda isoforma delle VDAC umane.