Genetic control of grain yield components: the functional roles of Growth Regulating Factors (GRFs) and Laccases (LACs) in barley [Controllo genetico dei componenti della resa nel seme: il ruolo funzionale dei Growth Regulating Factors (GRF) e delle Laccasi (LAC) in orzo]

Grain yield is a complex trait governed by multiple genetic and environmental factors, including spike fertility, seed number, and seed size. Addressing the challenge of global food security necessitates the identification and functional characterization of key genes involved in yield-related processes. This thesis investigates two gene families: Growth Regulating Factors (GRFs) and LACCASEs (LACs) as regulators of grain yield potential in barley (Hordeum vulgare), a model crop within the Triticeae tribe. The primary focus of this work is on GRFs, a family of transcription factors involved in plant development and regulated post-transcriptionally by miR396. Among the GRF family members, HvGRF4a was selected for in-depth investigation because of its specific expression in reproductive tissues and orthology to OsGRF4, a known regulator of grain size and nitrogen/carbon balance in rice. Using a combination of ectopic expression, CRISPR/Cas9-based knockout mutants, and FIND-IT (Fast Identification of Nucleotide variants by droplet digital PCR) alleles with altered miR396 binding site sequence, we examined the role of HvGRF4a in seed development. HvGRF4a ectopic expression led to increased seed length associated with partial male sterility. Conversely, the FIND-IT line, which showed mild HvGRF4a upregulation, exhibited increased grain size without negative effects on fertility. Magnetic Resonance Imaging (MRI) analysis revealed larger embryos on genetic backgrounds with increased HvGRF4a expression, while Time Domain Nuclear Magnetic Resonance (TD-NMR) and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) analyses indicated altered carbon-to-nitrogen ratios in the endosperm of overexpressing lines. The absence of relevant seed phenotypes in CRISPR/Cas9-based Hvgrf4a knockout plants suggested functional redundancy among GRFs. To further dissect the functional role of HvGRF4a, we performed a DNA Affinity Purification sequencing (DAP-seq) experiment which provided a list of candidate target genes. In addition, we ectopically expressed both HvGRF4a and Hv-RGRF4a, the latter carrying SNPs that abolish miR396 binding without altering the amino acid sequence, in durum wheat (cv. Svevo). Preliminary results indicate an effect on plant architecture, particularly plant height, in plants harboring the Hv-RGRF4a version. These plants also displayed longer and shrunken seeds, alongside a high level of sterility and some spikelets exhibited an increased number of florets. The same supernumerary floret phenotype was also observed in T0 lines overexpressing HvGRF4a in association with complete sterility. The latter part of the thesis presents an in silico characterization of the LACCASE gene family in barley. LACCASE enzymes play critical roles in lignin polymerization and cell wall modification, and their transcripts are regulated by the activity of miR397 family. Studies in rice and Arabidopsis highlighted that modulation of miR397 expression influences lignification, promoting cell elongation and increasing seed size. Understanding the composition of the HvLAC gene family in barley is essential to identify promising candidates for functional analysis aimed at improving yield-related traits. We identified 25 HvLACs in the barley cultivar ‘Morex’ and 26 in the cultivar ‘Golden Promise’ and ‘B1K-04-12’ (H. vulgare subsp. spontaneum). For each genotype, we performed an in silico characterization of biochemical parameters, promoter regions, and expression profiles retrieved from online databases. Our aim was to uncover differences among the genetic backgrounds and ultimately identify the most promising HvLAC candidates for functional studies aimed at increasing grain yield components. This work integrates molecular and phenotypic approaches, to describe specific genetic networks influencing grain yield components in barley. The molecular information gained in this work is expected to support the development of barley lines characterized by an increased yield potential.

La resa in granella è un carattere complesso, regolato da molteplici fattori genetici e ambientali, tra cui la fertilità della spiga, il numero di semi e le dimensioni del seme. Affrontare la sfida della sicurezza alimentare globale richiede l’identificazione e la caratterizzazione funzionale dei geni chiave coinvolti nei processi legati alla resa. Questa tesi analizza due famiglie geniche: i Growth Regulating Factors (GRFs) e le LACCASI (LACs) come regolatori del potenziale produttivo della granella nell’orzo (Hordeum vulgare), una coltura modello all’interno della tribù delle Triticeae. La maggior parte di questo lavoro si concentra sui GRF, una famiglia di fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo delle piante e regolati post-trascrizionalmente da miR396. Tra i GRF, HvGRF4a è stato selezionato per un’indagine più approfondita grazie alla sua specifica espressione nei tessuti riproduttivi e alla sua ortologia con OsGRF4, un noto regolatore della dimensione del seme e del bilancio azoto/carbonio nel riso. Attraverso una combinazione di espressione ectopica, mutanti knockout ottenuti tramite CRISPR/Cas9 e alleli FIND-IT (Fast Identification of Nucleotide variants by droplet digital PCR) che mostrano un sito di legame di miR396 alterato, abbiamo esaminato il ruolo di HvGRF4a nello sviluppo del seme. L’espressione ectopica di HvGRF4a ha portato ad un aumento della lunghezza del seme, associato a parziale sterilità. Al contrario, la linea FIND-IT, che mostrava una lieve sovraespressione di HvGRF4a, ha evidenziato un aumento delle dimensioni della granella senza effetti negativi sulla fertilità. Le analisi tramite Risonanza Magnetica (MRI) hanno rivelato embrioni più grandi in background genetici con maggiore espressione di HvGRF4a, mentre le analisi TD-NMR (Time Domain Nuclear Magnetic Resonance) e NIRS (Near Infrared Spectroscopy) hanno indicato rapporti carbonio/azoto alterati nelle linee over esprimenti. L’assenza di fenotipi significativi nei semi delle piante knockout Hvgrf4a basate su CRISPR/Cas9 ha suggerito una possibile ridondanza funzionale tra i GRF. Per approfondire ulteriormente il ruolo funzionale di HvGRF4a, è stato eseguito un esperimento di DAP-seq (DNA Affinity Purification sequencing), che ha fornito una lista di geni candidati target. Inoltre, sono stati espressi ectopicamente sia HvGRF4a che Hv-RGRF4a (quest’ultimo contenente SNPs che aboliscono il legame con il miR396 senza alterare la sequenza amminoacidica) nel grano duro cv. ‘Svevo’. Risultati preliminari hanno evidenziato un effetto sull’architettura della pianta, in particolare sull’altezza, nelle piante trasformate con Hv-RGRF4a. Queste piante hanno anche prodotto semi più lunghi e striminziti, un alto livello di sterilità e, in alcuni casi, spighette con un numero maggiore di fiori. Lo stesso fenotipo di fiori sovrannumerari è stato osservato anche nelle linee di frumento duro T0 overesprimenti HvGRF4a, associato a sterilità completa. Nella parte finale della tesi viene presentata una caratterizzazione in silico della famiglia genica LACCASI nell’orzo. Gli enzimi LACCASI svolgono ruoli cruciali nella polimerizzazione della lignina e nella modifica della parete cellulare, e sono regolati post-trascrizionalmente dalla famiglia miR397. Studi in riso e Arabidopsis hanno evidenziato che la modulazione dell’espressione di miR397 influenza la lignificazione, favorendo l’incremento della dimensione cellulare e di conseguenza incrementando la dimensione del seme. Comprendere la composizione della famiglia genica HvLAC nell’orzo è fondamentale per identificare candidati promettenti per analisi funzionali mirate al miglioramento dei tratti legati alla resa. Abbiamo identificato 25 LACs nella cultivar di orzo ‘Morex’ e 26 in ‘Golden Promise’ e ‘B1K-04-12’ (H. vulgare subsp. spontaneum). Per ciascun genotipo è stata condotta una caratterizzazione in silico dei parametri biochimici, delle regioni promotrici e dei profili di espressione, ricavati da database online. L’obiettivo era individuare differenze tra i background genetici e selezionare i geni HvLAC più promettenti per studi funzionali finalizzati all’aumento dei componenti della resa in granella. In sintesi, questo lavoro integra approcci molecolari e fenotipici per descrivere network genetici che influenzano i componenti della resa in granella nell’orzo. Le informazioni molecolari ottenute sono destinate a supportare lo sviluppo di linee di orzo caratterizzate da un incremento del potenziale produttivo.