La signalisation du recepteur cannabinoïde de type-1 et son role dans la regulation de la dynamique du lactate cerebral chez la souris en libre mouvement [Il recettore cannabinoide di tipo 1 nella modulazione delle dinamiche del lattato cerebrale in topi in libero movimento]

The brain is one of the most active metabolic organs in the body. Despite accounting for only ~2% of total body weight, it consumes up to 20% of the body's energy. This energy is primarily derived from glucose metabolism, which produces both ATP and lactate. In the central nervous system (CNS), astrocytes are the main source of lactate, generated mostly via aerobic glycolysis. Neurons, in contrast, rely largely on oxidative phosphorylation for ATP production and preferentially utilize lactate as an energy substrate in a process known as the astrocyte-to-neuron lactate shuttle (ANLS). Beyond its metabolic role, lactate also functions as a key signalling molecule involved in neuronal plasticity, memory, and behavioural regulation. However, the mechanisms controlling lactate production and release in the brain remain poorly understood. Recent findings have implicated the cannabinoid receptor type 1 (CB1R) in the regulation of astrocytic metabolism. Persistent activation of astroglial mitochondrial CB1Rs (mtCB1Rs) for 24 hours has been shown to suppress lactate production. In contrast, our recent work reveals that transient (5 minutes) stimulation of CB1Rs in astrocytes triggers a transient increase in lactate levels. While these effects have been observed in vitro, the impact of CB1R activation on brain lactate dynamics in vivo has yet to be directly examined. In this thesis, we address this gap using fiber photometry (FP) and eLACCO2.1, a genetically encoded fluorescent biosensor for extracellular lactate. We successfully established a protocol to monitor lactate dynamics in freely moving mice and validated the responsiveness of the sensor to exogenous lactate administration. Our in vivo experiments revealed that lactate levels are modulated not only by cannabinoid exposure but also by behavioural state, particularly locomotor activity. Specifically, we observed brain region-specific patterns in lactate fluctuations during periods of immobility and following Δ⁹-THC administration, suggesting that CB1R activation alters the timing and dynamics of lactate regulation in a circuit-dependent manner. In parallel, we investigated the intracellular signalling mechanisms underlying CB1R-dependent regulation of lactate in cultured astrocytes, with a particular focus on the switch between the transient and persistent effects induced by WIN55 stimulation. Using the broad PKC inhibitor Go 6983, we found that PKC activity is required for both the transient lactate increase and the later suppression induced by CB1R stimulation. Blocking PKC abolished both effects, indicating that it serves as a critical molecular switch within the CB1R-lactate signalling axis. Interestingly, a progressive accumulation of lactate was observed when PKC was inhibited in the presence of CB1R activation. Control experiments with PKC inhibition alone did not show changes in baseline lactate levels, although technical limitations prevented full quantification. Together, these findings establish a new in vivo method for studying lactate dynamics in freely moving mice, demonstrate that Δ⁹-THC alters brain lactate dynamics specifically during periods of immobility, suggesting that CB1R signalling reshapes neurometabolic responses in relation to behavioural state and brain region, and uncover a previously not fully characterized role for PKC in astrocyte metabolic regulation. This work advances our understanding of the complex interplay between cannabinoid signalling, astrocyte function and behaviour, and sets the stage for future studies into the neurometabolic consequences of CB1R activity.

Il cervello è uno degli organi metabolicamente più attivi dell’organismo. Pur rappresentando solo circa il 2% del peso corporeo totale, consuma fino al 20% dell’energia complessiva. Questa energia deriva principalmente dal metabolismo del glucosio, che porta alla produzione sia di ATP che di lattato. Nel sistema nervoso centrale (SNC), gli astrociti costituiscono la principale fonte di lattato, generato prevalentemente attraverso la glicolisi aerobica. I neuroni, al contrario, dipendono in larga misura dalla fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP e utilizzano preferenzialmente il lattato come substrato energetico in un processo noto come astrocyte to neuron lactate shuttle (ANLS). Oltre al suo ruolo metabolico, il lattato agisce anche come una molecola di segnalazione chiave, coinvolta nella plasticità neuronale, nella memoria e nella regolazione del comportamento. Tuttavia, i meccanismi che controllano la produzione e il rilascio di lattato nel cervello restano ancora poco chiari. Recenti studi hanno implicato il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 (CB1R) nella regolazione del metabolismo astrocitario. L’attivazione persistente dei CB1R mitocondriali (mtCB1R) negli astrociti per 24 ore è stata associata a una riduzione della produzione di lattato. Al contrario, lavori recenti del nostro laboratorio hanno mostrato che una stimolazione transitoria (5 minuti) dei CB1R negli astrociti induce un aumento temporaneo dei livelli di lattato. Sebbene questi effetti siano stati osservati in vitro, l’impatto dell’attivazione dei CB1R sulle dinamiche del lattato cerebrale in vivo non era ancora stato esaminato direttamente. In questa tesi abbiamo affrontato tale questione utilizzando la fiber photometry (FP) e eLACCO2.1, un biosensore fluorescente geneticamente codificato per la rilevazione del lattato extracellulare. Abbiamo messo a punto un protocollo per monitorare le dinamiche del lattato in topi liberi di muoversi e validato la sensibilità del sensore alla somministrazione di lattato esogeno. Gli esperimenti in vivo hanno rivelato che i livelli di lattato sono modulati non solo dall’esposizione ai cannabinoidi, ma anche dallo stato comportamentale, in particolare dall’attività locomotoria. In modo specifico, abbiamo osservato variazioni del lattato dipendenti dalla regione cerebrale durante le fasi di immobilità e dopo la somministrazione di Δ⁹-THC, suggerendo che l’attivazione dei CB1R modula la tempistica e la dinamica della regolazione del lattato in maniera circuito-dipendente. In parallelo, abbiamo indagato i meccanismi di segnalazione intracellulare alla base della regolazione del lattato mediata dai CB1R in astrociti coltivati, concentrandoci in particolare sul passaggio tra gli effetti transitori e persistenti indotti dalla stimolazione con WIN55. Utilizzando l’inibitore ad ampio spettro della PKC, Go 6983, abbiamo scoperto che l’attività della PKC è necessaria sia per l’aumento transitorio del lattato sia per la successiva riduzione indotta dall’attivazione dei CB1R. Il blocco della PKC ha abolito entrambi gli effetti, indicando che essa funge da interruttore molecolare critico all’interno dell’asse di segnalazione CB1R-lattato. È interessante notare che, in presenza di inibizione della PKC e contemporanea attivazione dei CB1R, si è osservata un’accumulazione progressiva di lattato. Gli esperimenti di controllo con la sola inibizione della PKC non hanno mostrato variazioni dei livelli basali di lattato, sebbene limitazioni tecniche abbiano impedito una quantificazione completa. Complessivamente, questi risultati stabiliscono un nuovo metodo in vivo per lo studio delle dinamiche del lattato in animali liberi di muoversi, dimostrano che il Δ⁹-THC altera le dinamiche del lattato cerebrale specificamente durante le fasi di immobilità, suggerendo che la segnalazione mediata dai CB1R rimodella le risposte neurometaboliche in relazione allo stato comportamentale e alla regione cerebrale, e rivelano inoltre un ruolo precedentemente non completamente caratterizzato della PKC nella regolazione metabolica degli astrociti. Questo lavoro approfondisce la comprensione delle complesse interazioni tra la segnalazione cannabinoide, la funzione astrocitaria e il comportamento, ponendo le basi per futuri studi sulle conseguenze neurometaboliche dell’attività dei CB1R.