Automatic Electrorotation-based Cell-Physiometry Platform [Piattaforma Automatica di elettrofisiometria cellulare basata sull'elettrorotazione]

Electrokinetic techniques have gained growing attention as label-free and non-invasive tools for investigating the dielectric properties of biological cells. These approaches enable cell characterization and manipulation by exploiting the interaction between external electric fields and the induced dipole movement of the cells. Among them, Electrorotation (ROT) is one of the most accurate and informative methods for analyzing the dielectric response of individual cells. This technique allows to extract information about the cell membrane in the low-frequency regime and the cytoplasm in the high-frequency regime, which together form the cell's dielectric signature. Conventional techniques for cellular characterization, such as flow cytometry, rely on chemical labels, which limit their scalability, invasiveness, and real-time applicability. These constraints highlight the need for automated, low-cost, and portable systems capable of performing dielectric analysis under fully controlled and reproducible conditions. This research thesis presents the design, development, and validation of a fully integrated ROT-based platform for high-throughput and automated dielectric cell characterization. The work spans from hardware realization to software automation and biological validation, progressively advancing the state of the art in electrokinetic analysis. First, an automated low-frequency ROT platform was developed to analyze membrane-dominated electrorotation measurements. This initial platform comprises a Quadrature Signal Generator (QSG) electronic system and a first-generation angular-velocity extraction algorithm, the PiXel Intensity Algorithm (PxI). This setup allows for accurate and repeatable measurement of the angular velocity of multiple cells, enabling the derivation of their dielectric signature. The platform was experimentally validated with distinct cell lines—CaCo-2, CCD-841, and OPM2—demonstrating reliable discrimination capabilities and quantitative robustness in determining the membrane capacitance characteristics. The platform was then validated using Multiple Myeloma (MM) plasma cells exhibiting different metabolic and drug-resistance profiles. The results show that ROT analysis can distinguish tumor subpopulations based on intrinsic dielectric signatures, supporting its potential role as a complementary tool to conventional minimal residual disease (MRD) detection techniques. Following the development of the initial low-frequency ROT platform and its biological validation, the need emerged to further enhance the system in terms of experimental throughput and spectral completeness. In particular, clinically relevant investigations required both scalable data processing and the extension of dielectric characterization across the full ROT frequency spectrum through the integration of high-frequency operation. To address these, the Electro-Cell Physiometry (ECP) Framework and the High-Frequency Quadrature Signal Generator (HF-QSG) have been developed. The ECP-Framework is a comprehensive and fully automated software environment governing the entire analytical pipeline, from image segmentation and cell tracking to angular velocity estimation and dielectric parameter extraction. At its core, the framework integrates POLARIS, a dedicated rotational analysis algorithm that significantly enhances estimation precision, robustness to noise, and reproducibility. Validation was conducted using both simulated datasets, generated through a dedicated experimental ROT digital-twin developed---\textit{Electrorotation Game}---, and experimental measurements. Finally, the HF-QSG extended the previous QSG version toward higher frequencies, enabling full ROT spectral acquisition and a more comprehensive dielectric characterization of intracellular structures. Overall, this thesis provides a unified technological and methodological foundation for automated ROT-based cell analysis. By implementing a fully automated and standardized workflow, the developed ROT platform enables reproducible characterization that does not require expert intervention, allowing non-engineering operators to perform high-throughput dielectric cell analysis reliably. This highlights the critical role of systematic automation and precise process control in ensuring quantitative, scalable, and reproducible measurements. Moreover, by integrating hardware design, advanced computational pipelines, and biological validation, it demonstrates how ROT can evolve from a laboratory technique to a robust, operator-independent, and reproducible tool, suitable for high-throughput diagnostics and monitoring for next-generation bioelectronic and clinical applications.

Le tecniche elettrocinetiche hanno guadagnato crescente attenzione come strumenti non invasivi e label-free per studiare le proprietà dielettriche delle cellule biologiche. Questi approcci consentono la caratterizzazione e la manipolazione delle cellule sfruttando l'interazione tra campi elettrici esterni e il movimento dipolare indotto delle cellule. Tra questi, l'elettrorotazione (ROT) è uno dei metodi più accurati e informativi per analizzare la risposta dielettrica delle singole cellule. Questa tecnica consente di estrarre informazioni sulla membrana cellulare nel regime a bassa frequenza e sul citoplasma nel regime ad alta frequenza, che insieme formano la firma dielettrica della cellula. Le tecniche convenzionali di caratterizzazione cellulare, come la citometria a flusso, si basano su sostanze chimiche, che ne limitano la scalabilità, l'invasività e l'applicabilità in tempo reale. Questi vincoli evidenziano la necessità di sistemi automatizzati, a basso costo e portatili in grado di eseguire analisi dielettriche in condizioni completamente controllate e riproducibili. Questa tesi di ricerca presenta la progettazione, lo sviluppo e la validazione di una piattaforma completamente integrata basata su ROT per la caratterizzazione dielettrica automatizzata e ad alto rendimento delle cellule. Il lavoro spazia dalla realizzazione hardware, all'automazione e allo sviluppo software e alla validazione biologica, facendo progressivamente avanzare lo stato dell'arte nell'analisi elettrocinetica. Innanzitutto, è stata sviluppata una piattaforma ROT automatizzata a bassa frequenza per analizzare il regime di elettrorotazione dominato dalla membrana cellulare. Questa piattaforma iniziale comprende un sistema elettronico Quadrature Signal Generator (QSG) e un algoritmo di estrazione della velocità angolare di prima generazione, il PiXel Intensity Algorithm (PxI). Questa configurazione consente una misurazione accurata e ripetibile della velocità angolare di più celle, consentendo la derivazione della loro firma dielettrica. La piattaforma è stata validata sperimentalmente con linee cellulari distinte —CaCo-2, CCD-841 e OPM2— che dimostrano capacità di discriminazione affidabili e robustezza quantitativa nel determinare le caratteristiche della capacità della membrana. La piattaforma è stata poi validata utilizzando plasmacellule di mieloma multiplo (MM) che presentano diversi profili metabolici e di resistenza ai farmaci. I risultati dimostrano che l'analisi ROT è in grado di distinguere le sottopopolazioni tumorali in base alle firme dielettriche intrinseche, supportando il suo potenziale ruolo come strumento complementare alle tecniche convenzionali di rilevamento della malattia minima residua (MRD). In seguito allo sviluppo della piattaforma ROT iniziale a bassa frequenza e alla sua validazione biologica, è emersa la necessità di migliorare ulteriormente il sistema in termini di produttività sperimentale e completezza spettrale. In particolare, le indagini clinicamente rilevanti hanno richiesto sia un'elaborazione dati scalabile sia l'estensione della caratterizzazione dielettrica all'intero spettro di frequenza ROT mediante l'integrazione del funzionamento ad alta frequenza. A tal fine, sono stati sviluppati Electro-cell Physiometry (ECP) Framework e il generatore di segnali in quadratura ad alta frequenza (HF-QSG). L'ECP-Framework è un ambiente software completo e completamente automatizzato che governa l'intera pipeline analitica, dalla segmentazione delle immagini e dal tracciamento delle cellule, alla stima della velocità angolare e all'estrazione dei parametri dielettrici. Fondamentalmente, il framework integra POLARIS, un algoritmo dedicato all'analisi rotazionale che migliora significativamente la precisione della stima, la robustezza al rumore e la riproducibilità rispetto all'algoritmo precedentemente proposto. La validazione sperimentale è stata condotta utilizzando sia un set di dati simulati, generati tramite un digital twin ROT dedicato sviluppato (Electrorotation Game), sia un set di misurazioni sperimentali. Infine, l'HF-QSG ha esteso la precedente versione QSG verso frequenze più elevate, consentendo l'acquisizione spettrale ROT completa e una caratterizzazione dielettrica più completa delle strutture intracellulari. Nel complesso, questa tesi fornisce una base tecnologica e metodologica unificata per l'analisi cellulare automatizzata basata su ROT. Implementando un flusso di lavoro completamente automatizzato e standardizzato, la piattaforma ROT sviluppata consente una caratterizzazione riproducibile che non richiede l'intervento di esperti, consentendo agli operatori non ingegneri di eseguire in modo affidabile analisi dielettriche di cellule ad alto rendimento. Ciò evidenzia il ruolo fondamentale dell’automazione sistematica e del controllo preciso dei processi nel garantire misurazioni quantitative, scalabili e riproducibili. Inoltre, integrando progettazione hardware, pipeline computazionali avanzate e validazione biologica, dimostra come ROT possa evolversi da tecnica di laboratorio a strumento robusto, indipendente dall'operatore e riproducibile, adatto per la diagnostica e il monitoraggio ad alto rendimento per applicazioni bioelettroniche e cliniche di prossima generazione.