Il sistema dell'Eme Ossigenasi-1 (HO-1) nel Glioblastoma Multiforme

Gliomas are the most common primary tumours of the central nervous system (CNS) in the adult. Glioblastoma represents half of the newly diagnosed gliomas, and it is the most aggressive brain tumour with a median patient survival of 14-17 months. Heme oxygenase (HO) is the rate-limiting enzyme in the catabolism of heme: this two-step enzymatic reaction results in the formation of equimolar amounts of biliverdin, iron and carbon monoxide (CO). HO exists in two forms, HO-1, the inducible form, and HO-2, the constitutive form which degrades heme in an identical stereospecific manner. In human glioma tumours, HO-1 is overexpressed both when compared with normal brain tissues and also during oligodendroglioma progression. So far, the molecular mechanisms triggered by HO-1 to promote glioblastoma remains unknown. In the first part of the project HO-1 was induced by hemin treatment (10 M) whereas VP13/47 (100 M) was used as a specific non-competitive inhibitor of its activity. Carbon Monoxide Releasing Molecules (CORMs) (i.e. CORM-3 and CORM-A1) were also used in a separate set of experiments to confirm the effect of HO-1 by-product. Our results were further validated using GSE4412 microarray dataset analysis and comparing biopsies from patients overexpressing HMOX-1 with the rest of the cases. Hemin, but not CORMs treatment, resulted in a significant increase of cell proliferation following 24h of treatment as measured by increased cell index and colony formation capacity and such effect was abolished by VP13/47. Both hemin and CORMs showed a significant effect on the wound healing assay also exhibiting a cell specificity. Moreover, our dataset analysis showed a positive correlation of HMOX-1 gene expression with ITGBI and ITGBII which are membrane receptors involved in cell adhesion, embryogenesis, tissue repair, immune response and metastatic diffusion of tumour cells. In the second part of the project we analyzed the effects of estradiol (E2, 5nM) in human glioblastoma multiforme U87-MG cells and how it may impact on cell proliferation and mitochondrial fitness. In particular, mitochondrial fitness was evaluated by assessing the expression of gene involved in mitochondrial biogenesis (PGC1, SIRT1, TFAM), oxidative phosphorylation (ND4, Cytb, COX II, COX IV, Ndufa6, ATP synthase) and dynamics (OPA1, MNF2, MNF1, FIS1). Moreover, Nrf2 nuclear translocation was evaluated by immunocytochemical analysis. Taken all together, our data suggest that HO-1 and its byproduct CO exhibit a cell-specific effect on various aspects of disease progression and is associated with a complex series of molecular mechanisms driving cell proliferation, survival and metastasis; furthermore, E2 promotes proliferation in glioblastoma cells and regulate the expression of genes involved in mitochondrial fitness and chemoresistance pathway.

I Gliomi sono i tumori primari più comuni del sistema nervoso centrale (SNC) nell'adulto. Il glioblastoma rappresenta la metà dei gliomi diagnosticati ed è il tumore cerebrale più aggressivo con una sopravvivenza media dei pazienti di 14-17 mesi. L'Eme Ossigenasi (HO) è l'enzima che limita la velocità nel catabolismo dell'eme: questa reazione enzimatica in due fasi provoca la formazione di quantità equimolari di biliverdina, ferro e monossido di carbonio (CO). HO esiste in due forme, HO-1, la forma inducibile, e HO-2, la forma costitutiva che degrada l'eme in un identico modo stereospecifico. Nei tumori di glioma umano, HO-1 è overespresso sia rispetto ai tessuti cerebrali sani sia durante la progressione dell'oligodendroglioma. Finora, i meccanismi molecolari innescati da HO-1 per promuovere la crescita del glioblastoma rimangono sconosciuti. Nella prima parte del progetto HO-1 è stato indotto dal trattamento con Emina (10 M) mentre il VP13/ 47 (100 M) è stato utilizzato come specifico inibitore non competitivo della sua attività. Le molecole a rilascio di monossido di carbonio (CORM) (ovvero CORM-3 e CORM-A1) sono state usate anche in una serie separata di esperimenti per confermare l'effetto del sottoprodotto della reazione. I nostri risultati sono stati ulteriormente validati utilizzando l'analisi del set di dati microarray GSE4412 e confrontando le biopsie di pazienti che hanno valori di espressione di HMOX-1 elevati rispetto agli altri pazienti. L'Emina, ma non il trattamento con i CORM, ha determinato un aumento significativo della proliferazione cellulare dopo 24 ore di trattamento: ciò è stato misurato dall'aumento dell'indice cellulare e dalla capacità di formazione delle colonie e tale effetto è stato revertito da VP13/47. Sia l’Emina che i CORM hanno mostrato un effetto significativo sul test di migrazione mostrando anche una specificità cellulare. Inoltre, la nostra analisi del set di dati ha mostrato una correlazione positiva dell'espressione del gene HMOX-1 con ITGBI e ITGBII che sono recettori di membrana coinvolti nell'adesione cellulare, l'embriogenesi, la riparazione dei tessuti, la risposta immunitaria e la diffusione metastatica delle cellule tumorali. Nella seconda parte del progetto abbiamo analizzato gli effetti dell'estradiolo (E2, 5nM) nelle linea cellulare U87-MG di glioblastoma multiforme umano e per verificare un effetto sulla proliferazione cellulare e sulla forma mitocondriale. In particolare, il benessere mitocondriale è stata valutato tramite l'espressione dei geni coinvolti nella biogenesi mitocondriale (PGC1, SIRT1, TFAM), nella fosforilazione ossidativa (ND4, Cytb, COX II, COX IV, Ndufa6, ATP sintetasi) e dinamica (OPA1, MNF2 , MNF1, FIS1). Inoltre, la traslocazione nucleare di Nrf2 è stata valutata mediante analisi immunocitochimica. Nel loro insieme, i nostri dati suggeriscono che HO-1 e il suo sottoprodotto CO mostrano un effetto specifico sulle cellule su vari aspetti della progressione della malattia ed è associato a una serie complessa di meccanismi molecolari che guidano la proliferazione cellulare, la sopravvivenza e le metastasi; inoltre, l'E2 promuove la proliferazione nelle cellule del glioblastoma e regola l'espressione dei geni coinvolti nel benessere mitocondriale e nella chemioresistenza.