DESIGN, SINTESI ED ESPRESSIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI PER LO SVILUPPO DI UN VACCINO EPATITE E-MALARIA

The aim of this doctoral thesis project was to develop a multivalent recombinant vaccine candidate against malaria and against hepatitis E. The research was conducted via a collaboration between the Department of Pharmaceutical and Health Sciences, Section of Biochemistry, of the University of Catania and Etna Biotech S.r.l, Catania, Italy (PON RI 2014-2020). To select the antigens predominantly expressed in the different phases of the Plasmodium falciparum life cycle, first in silico design studies were conducted. The obtained results allowed to select a Plasmodium falciparum target gene predominant in the pre-erythrocyte phase of the parasite encoding the Circumsporozoitic protein (CSP), the Plasmodium falciparum protein domain related to the region-2 (PfF2) and the chimeric gene MSPFu24, corresponding to the immunodominant regions, related to the Merozoite surface proteins of the erythrocyte phase 1 and 3 (MSP1 and MSP3) of the parasite. In addition, it was selected from Hepatitis E virus (HEV) a viral capsidic protein P239, highly immunogenic, that was inserted to the 5 'end of the malarial genes. To develop a "combined Malaria-hepatitis E" vaccine with "additive" or "synergistic" effects, starting from the design procedure and subsequent cloning of the recombinant HEV-CSP, HEV-PfF2 and HEV-MSPFu24 genes, three recombinant proteins were obtained in cell cultures of Pichia pastoris, a methyl-trophic yeast with a strong promoter highly inducible, were extracted and partially purified. The experimental activities continued with the selection at "lab-scale" level of recombinant clones that best expressed their desired proteins to subsequently use them on a large scale in industrial fermenters, after defining the optimal methanol-induction conditions. The results allowed to highlight a considerable variation of expression between the pre-induction phase and the induction phase, carried out by adding methanol, in the selected clones. It has been observed that induction for 5 days with 10% methanol proved to be the most suitable in achieving expression optimum for a recombinant proteins and, in particular, for HEV-CSP. We therefore focused our attention on a single recombinant protein, HEV-CSP, and we started a downstream processing, to obtain a partial purification of the protein under examination. Partial purification of the target protein HEV-CSP was conducted via ion exchange chromatography; first using linear chromatography and then 4-steps chromatography, where ysedifferent Elution Buffer concentrations were deployed. Recombinant HEV-CSP heterologous protein is currently in a subsequent purification phase: various strategies are being evaluated to obtain a suitable level of purity, to be suitably formulated in a single "protein-based" vaccine candidate, in presence or absence of adjuvants, in subsequent pre-clinical immunization studies in an animal model.

Obiettivo di questo progetto di tesi di dottorato di ricerca è stato quello di sviluppare un candidato vaccino multivalente/multifasico contro la malaria e l’Epatite E. La ricerca è stata condotta in collaborazione tra il Dipartimento di Scienze del Farmaco e della Salute, Sezione di Biochimica, dell’Università di Catania e l’Etna Biotech S.r.l, Catania, Italia (PON RI 2014-2020). Per selezionare gli antigeni prevalentemente espressi nelle diverse fasi del ciclo di vita di Plasmodium falciparum, sono stati condotti inizialmente studi di design in silico. I risultati ottenuti hanno consentito di selezionare un gene target di Plasmodium falciparum predominante nella fase pre-eritrocitaria del parassita codificante per la proteina Circumsporozoitica (CSP), il dominio proteico di Plasmodium falciparum relativo alla regione-2 (PfF2) e il gene chimerico MSPFu24 corrispondente alle regioni immunodominanti relative alle proteine di superficie del Merozoite della fase eritrocitaria 1 e 3 (MSP1 e MSP3) del parassita. Inoltre, è stata selezionata dal virus dell’Epatite E (HEV) la proteina capsidica virale P239, altamente immunogenica, la quale è stata inserita all’estremità 5’ dei geni malarici. Per sviluppare un vaccino "combinato Malaria-epatite E" con effetti "additivi" o "sinergici", partendo dalla procedura di design e dal successivo clonaggio dei geni ricombinanti HEV-CSP, HEV-PfF2 e HEV-MSPFu24, sono state ottenute tre proteine ricombinanti in colture cellulari di Pichia pastoris, un lievito metilotrofico con un promotore forte ed inducibile, sono state estratte e parzialmente purificate. Le attività sperimentali sono proseguite con la selezione a livello "lab-scale" dei cloni ricombinanti che meglio esprimessero le proteine desiderate per poterle utilizzare, successivamente, su larga scala in fermentatori industriali, dopo aver definito le condizioni ottimali di metanolo-induzione. I risultati ottenuti hanno consentito di evidenziare una notevole variazione di espressione tra la fase di pre-induzione e la fase di induzione, effettuata mediante aggiunta di metanolo, in tutti i cloni selezionati. In particolare, è stato rilevato che l'induzione per 5 giorni con metanolo al 10% rappresentava la condizione migliore per ottenere l'espressione ottimale delle proteine ricombinanti e soprattutto per quella relativa alla proteina ricombinante HEV-CSP. Abbiamo quindi focalizzato la nostra attenzione su una sola proteina ricombinate, HEV-CSP, e abbiamo iniziato un downstream processing, per ottenere una parziale purificazione della proteina in esame. Dopo una ultrafiltrazione e diversi approcci cromatografici, la cromatografia a scambio ionico in condizioni di eluizione a pH neutro e con gradiente lineare e successivamente a 4 steps, ci ha permesso di purificare parzialmente la proteina target HEV-CSP. Sono attualmente in corso studi di purificazione per ottenere un adeguato livello di purezza della suddetta proteina, al fine di formulare opportunamente in un singolo vaccino candidato "protein-based", in presenza o meno di adiuvanti, da utilizzare in successivi studi pre-clinici di immunizzazione in modello animale.